乳製品中A2 β-酪蛋白的檢測技術

近年來，標榜含有A2 β-酪蛋白（簡稱CN）的乳製品（通常被稱為A2乳製品，例如“A2牛奶”和“A2奶粉”）價格遠高於同類標準產品。 A2 β-酪蛋白的存在已成為乳製品品質的關鍵指標。然而，目前尚無任何國家製定A2乳製品的標準，這給監管帶來了挑戰。

牛奶的基本成分

乳製品包括液態奶，例如牛奶、羊奶和駱駝奶，以及它們的製品。乳製品是指主要以乳製品為原料，經由加熱、乾燥、冷凍或發酵等製程製成的各種液態或固態食品。由於牛奶已成為我們日常生活中不可或缺的營養飲品，本文將介紹牛奶的基本成分。

牛奶由水和乾物質組成。乾物質包括脂肪、蛋白質、乳糖、無機鹽等。各成分的比例通常如下：

• 水分：85.5%-89.5%（平均87.5%）；
• 脂肪：2.5%-6.0%（平均3.9%）；
• 蛋白質：2.9%-5.0%（平均3.4%）；
• 乳糖：3.6%-5.5%（平均4.8%）；
• 無機鹽：0.6%-0.9%（平均0.8%）；

其他：微量元素、維生素、膽固醇等。

普通牛奶中的總乳固體含量，或去除水分後的“乾物質”，代表了牛奶的營養價值。其含量通常在 10.5% 到 14.5% 之間，可以使用弗萊士曼公式計算：
T = 0.25L+1.2F±K

在哪裡：

• T - 總乳固體（%）；
• L - 牛奶密度（g/mL）；
• F - 脂肪（%）；
• K 係數（根據當地測試確定；中國的標準為 0.14）。
  
  值得注意的是，牛奶和羊駝奶中的蛋白質都是完全蛋白質，包含所有必需胺基酸。與母乳相比，牛奶的乳糖和寡糖含量較低，但酪蛋白和礦物質含量較高。牛奶的蛋白質含​​量也遠高於母乳（見圖1）。
  
  
  A2型β-酪胺酸激酶的起源與特徵
  
  乳蛋白主要由乳清蛋白和氰鈷胺組成。在母乳中，氰鈷胺約佔蛋白質含量的50%，而在牛奶中，其含量可達80%。 GB 31638-2016《國家食品安全標準－酪蛋白》將氰鈷胺定義為「透過酸、酵素或膜分離製程從牛奶和/或乳製品中獲得的產物，由α、β、κ和γ及其同工酶的混合物組成」。母乳蛋白主要由β-氰鈷胺組成，它是嬰幼兒氨基酸、磷和鈣的來源，並在胃中形成凝乳以進行消化。 β-氰鈷胺是主要的酪蛋白，約佔酪蛋白總量的30%-40%。天然存在的β-氰鈷胺素共有12種變體：A1、A2、A3、B、C、D、E、F、G、H1H2和I，其中以A1和A2最為常見。 β-氰鈷胺素及其酶解產物具有多種營養益處，包括促進鈣和鋅的吸收。雖然A1是普通牛奶中主要的β-氰鈷胺素，但A2也存在於羊奶和駱駝奶中。一杯250毫升的牛奶大約含有2克至3克β-氰鈷胺素（見圖2）。

研究表明，A2β-CN的胺基酸序列最為原始。目前在牛群中發現的A1β-CN變異體是A2胺基酸序列第67位脯胺酸（Pro）突變為組胺酸（His）所致（見圖3）。 A1β-CN可在人體內經由酵素水解生成7個胺基酸的β-酪啡肽（BCM-7），這是一種源自乳汁的生物活性鴉片肽，可活化內源性鴉片受體，進而產生生理反應。相較之下，A2β-CN很少水解生成內源性阿片肽。

流行病學研究已將BCM-7與某些疾病聯繫起來，包括增加第1型糖尿病、心臟病、新生兒猝死、呼吸功能障礙、胃腸道疾病以及自閉症和精神分裂症等神經系統疾病的風險。然而，這種關聯的程度仍需進一步驗證。

乳製品中A2型β-酪蛋白的檢測技術

目前國內外尚無A2乳製品的產品標準及檢測方法標準。文獻報告的相關方法標準和方法可以對β-酪蛋白進行定性和定量分析。

01 現有相關方法標準

（1）BJS 201915 含乳飲料及其乳原料中酪蛋白含量的測定。其原理是利用等電點沉澱法將樣品溶液中的酪蛋白重新溶解，用胰蛋白酶進行酶解，加入同位素內標，用C18水柱分離，最後採用液相層析-串聯質譜法（LC-MS/MS）和內標法進行定量分析。此方法可測定四種酪蛋白亞型：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的含量。

（2）T/CNHFA 003-2022 牛奶及乳製品中牛酪蛋白成分的定性測定。採用毛細管凝膠電泳法。

02 文獻中報導的分析方法

可歸納為兩類：一類是根據研究對象，分別分析乳牛基因型和最終產物；另一類是根據分析方法原理，分為定性分析和定量測定。

（1）基於研究對象

針對乳牛基因型：主要目的是選育A2型乳牛群並管理乳源。例如，PCR-限制性片段多態性（RFLP）、等位基因特異性PCR（AS-PCR）、TaqMan探針法和rhAmp技術可用於區分A1型乳牛、A1A2型乳牛和A2型乳牛，但難以監管或追蹤加工過程和產品中可能發生的交叉污染或摻假。例如，Nguyen等人（Food Chemistry，2019，https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.125532）採用乙酸銨沉澱CN，以尿素緩衝液複溶，在Agilent Poroshell 120 EC18層析管柱上分離，並以尿素緩衝液複溶，在Agilent Poroshell 120 EC18層析管柱上分離，並以分析方式進行分析。此方法能夠以高分析精度提供一系列β-酪蛋白變異體的分子量訊息，從而可以監測雜交乳牛所產牛奶中A2A2表型的頻率。 Nguyen等人的研究結果表明，A2A2乳牛的表型頻率始終小於1，這表明沒有發現僅產A2牛奶的乳牛品種。

對於液態乳和奶粉等最終產品，分析技術主要包括高效能液相層析法 (HPLC)、毛細管電泳、酵素連結免疫吸附試驗 (ELISA) 和蛋白質體學（即使用 MALDI-TOF、HPLC-MS 或 UHPLC-Orbitrap 等方法分析酵素消化後的完整蛋白質或特徵勝肽）。

（2）基於分析方法原理

定性分析包括毛細管凝膠電泳、ELISA 和 MALDI-TOF。

毛細管凝膠電泳：組別標準 T/CNHFA 003-2022 牛奶和乳製品中牛酪蛋白成分的定性檢測，可定性分析牛奶、山羊奶及其製品中的牛酪蛋白成分，最低檢測限 (LOD) 為 1%（成分質量比）。

ELISA：Biosensis 生產的牛 A1β/A2β 酪蛋白 ELISA 檢測試劑盒，檢測範圍為 6.25ng/mL 至 400ng/mL。

MALDI-TOF：Di Francesco L. 等人（Nutrients，2018，10，1238；doi：10.3390/nu10091238）利用此方法區分不同類型的奶粉。每種配方奶粉都有其獨特的特性。從一種配方奶粉切換到另一種配方奶粉會暴露出特定的蛋白質組，從而能夠識別摻假奶粉。

定量分析通常採用液相層析法（LC）或液相層析-質譜聯用法（LC-MS）。樣品預處理方法主要分為三類：

第一種方法是利用等電點沉澱法萃取氰化物（CN），然後洗滌沉澱物進行檢測。此方法所需試劑較少，可獲得純度較高的氰化物，但操作較為複雜。例如，前述方法標準BJS 201915採用等電點沉澱法處理樣品，可測定四種同分異構體：αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN的含量。此外，由於此方法可同時測定多種氰化物同分異構體（包括β-CN）的含量，因此可與A2標準品聯用，進一步定量A2 β-CN。

第二種方法是利用蛋白酶水解生成特徵勝肽。此方法定量準確，但成本較高。 Ehling S. 等人（《AOAC國際期刊》，104(6)，2021，1559–1566）使用胰蛋白酶對奶粉樣本中的酪蛋白進行酶解，加入同位素內標，並使用Peptide BEH C18色譜柱進行分離。以液相層析-串聯質譜法（LC-MS/MS）和內標法測定了β-酪蛋白（β-CN）和A1-β-酪蛋白（A1 β-CN）的含量。脫脂奶粉中A1-β-酪蛋白的定量限（LOQ）為0.01%。在實際應用中，此方法用於測定A2牛奶樣本中A1-β-酪蛋白的含量（範圍為0.26%至5.0%），並據此監測A2乳製品的品質。

第三種方法是利用尿素、鹽酸胍、二硫蘇糖醇、檸檬酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉等試劑破壞酪蛋白膠束並打開蛋白質二硫鍵，使蛋白質變性並檢測蛋白質含量。此處理方法能夠完全溶解蛋白質並展開其空間結構。此方法操作簡單但耗時較長，適用樣品範圍有限。例如，Lan Li等人（乳品科技，2022，45(2):18-23）採用液相層析法測定超高溫滅菌牛奶中的蛋白質含​​量。樣品經鹽酸胍、二硫蘇糖醇和無機鹽製備的緩衝溶液預處理後，採用液相層析-紫外線檢測法進行分析，並以外標法進行定量。此方法可測定α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳清蛋白及β-乳球蛋白，檢測極限為0.01-0.02 g/100 mL。 β-酪蛋白的保留時間為30.0 min。普通牛奶中的β-酪蛋白有三個峰值（B型、A1型和A2型）。牛奶中A2型β-酪蛋白的保留時間為31.5 min。此方法適用於鑑別滅菌乳汁中是否含有A2型β-酪蛋白。研究發現，對生乳和由同一生乳加工而成的奶粉進行檢測，發現A2型β-酪蛋白含量損失5%-10%。這可能是由於生乳在製粉過程中加熱時發生的美拉德反應所致。蛋白質上的酪胺酸殘基發生糖基化，阻礙了胰蛋白酶的切割，因為酪胺酸是胰蛋白酶的切割位點。然而，美拉德反應產生的糖化酪胺酸鈣與人體正常產生的糖蛋白不同，其生理功能可能降低或改變。因此，美拉德反應產生的糖基化β-酪胺酸鈣是否應歸類為β-酪胺酸鈣，仍需進一步探討。

03 發展趨勢及應用前景
鑑於色譜和質譜技術的廣泛應用，未來乳製品中A2 β-CN檢測的發展將集中在兩個方面：
（1）方法學。基於蛋白質體學，色譜-質譜聯用技術主要用於準確鑑定和定量蛋白質及其組成變化，進而準確定量乳製品中的A2 β-酪蛋白。可能面臨的問題有：首先是可追溯性問題，因為目前尚無商業認證的β-酪蛋白或其特徵勝肽標準樣本或物質（CRM）；其次是準確性問題。如果採用特徵勝肽進行定量，基於1摩爾目標蛋白水解1摩爾特徵勝肽的定量原理，鹼性胰蛋白酶無法完全酶解β-酪蛋白，這可能導致檢測值低於實際值。
（2）監理需求。建立可靠、準確的定性和定量分析方法標準，並制定相應乳製品（如「A2牛奶」或「A2奶粉」）的產品標準，不僅能為乳製品品質監管提供技術支持，還能為食品品質安全監管提供執法依據。

隨著消費者對乳製品品質要求的不斷提高和市場需求的增長，建立高效、準確的乳製品中A2 β-酪蛋白定性定量分析技術，並制定相應的方法標準和產品標準，對於「A2牛奶」或「A2奶粉」等產品的真實性追溯、交叉混入或摻假監測、產品配方不僅優化和品質控制至關重要，這不僅能保護消費者的權益，也能保護消費者的經濟效益。